2.1.1 从比例入手发现 Macro/Mono 重要性#

首先观察到 Macro/Mono 在 HM 的组织中占比明显升高 → 但是 Tricky 的是作者进一步画的图中好像 neut 的比例在 HM 中是明显更高的，剩下的在 PT 感觉还会多一些

2.1.2 细分亚群#

作者这里分类 10 个 subcluster：

• Mono：FCN1, S100A9, EREG, and THBS1
• Classical DC：CD1C, CST7, and FCER1A（most likely originated from normal pancreatic tissues）
• Macrophage：CD68+
  • M1 like
  • M2 like
  • 4 个 LAM（lipid-associated macrophages）：除了高 CD68，还有很高的脂代谢相关 marker（APOE, APOC1, and FABP5）
    • LAM
    • 1,2 高 SPP1 → TAM 分泌促进癌症
    • 3,4 高 CCL18 → 免疫抑制 & 促肿瘤

LAM1、2、3 在肿瘤中明显更多

CD68: 溶酶体相关膜蛋白（LAMP）家族，吞噬作用、溶酶体活性和细胞内物质降解

分布: 巨噬细胞（经典）、单核细胞、 DC & 粒细胞（低水平）

2.1.3 LAM 在 HM 中富集，看上调的通路#

进一步探究，LAM3 在 HM 明显增多？？

脂代谢相关 APOC1、APOE、FABP5 和 免疫相关 CCL18 在 HM 中表达更多（但是看 Dotplot 感觉没有很显著）

scMetabolism：看代谢

Go 富集对比 LAM3 的 HM，PT，NT

DEG: PLD3、LDHB、GSTO1 上调 没有进一步探究

一个很 tricky 的点，绘图的时候用 z Scale 一下，直接放大区别！

3.1.1 Spearman 相关系数 看亚群相似性#

1. 在每个亚群中，取出 标准差最大的前 1000 个基因，计算它们的平均表达
2. 对外周血亚群（PMN_01–05）和肿瘤内亚群（TAN_01–07）之间做 Spearman 相关性分析

相似方法：

1. 欧几里得距离 (Euclidean distance)：常见于 PCA 或聚类
2. Jensen-Shannon divergence (JSD)：比较概率分布相似性，在单细胞里常用来衡量 不同样本间 cell-type composition 的差异。
3. Label transfer (Seurat TransferData)：把 PMN 的标签转移到 TAN，看哪些 TAN 细胞最可能和 PMN 对应
4. Bhattacharyya Distance：比较不同组之间 细胞组成分布差异
5. Wasserstein / Earth Mover’s Distance, EMD：比较不同队列/不同状态的表达谱差异

3.1.2#

1. 预处理#

1. 数据预处理 (Preprocessing)

   • 原始输入：Visium 平台的测序结果，包括 demultiplex 后的 FASTQ 文件 + 对应 H&E 染色切片图像
   • 软件：Space Ranger
   • 步骤：
   • 使用 count 命令，对每个样本的 FASTQ 和 H&E 图像进行处理
   • 输出：得到 feature-barcode 矩阵 （unfiltered + filtered 两个版本）
     • 行：基因（features）
     • 列：空间位置的 barcode（即一个个 spot）
     • 值：该基因在该 spot 上的 UMI 数
   • HE 作用：提供 组织形态学信息 → H&E 图像和 Visium 芯片的 capture area 进行配准（align），确定每个 spot 对应组织里的哪个位置
     • 质控：帮助剔除没有组织覆盖的 spot（比如玻片边缘、空白区域）
     • 解释性：后续可以把基因表达图谱和病理形态结合，比如看哪个 cluster 对应肿瘤区、间质区或坏死区
     • Unfiltered matrix：所有 barcode 的基因表达，包括空白区域
     • Filtered matrix：去掉了没有组织覆盖、低质量的 barcode，只保留真实组织上的 spot

2. 构建 Seurat 对象

   • 将 filtered matrix 导入 R 中，使用 Load10X_Spatial 构建 Seurat 对象
   • 每张切片（slide）都单独建 Seurat object
   • 标准化 & 批次校正：
     • SCTransform —— vars.to.regress = c(‘nCount_Spatial’)，回归掉测序深度的影响
       • 不回归 mitoRatio → 避免把空间组织学特征误删，因为线粒体比例在 ST 里可能本身就是一个 空间模式（例如肿瘤坏死区 vs 间质区）
     • 多个对象合并后，利用 Harmony 对 PCA 结果进行批次校正（group.by.vars = c(‘orig.ident’, ‘technique_type’)）
       • 不同组织制备方式的样本需要矫正！

3. 降维与聚类

   • 邻居图构建：用 FindNeighbors
   • 聚类：用 Louvain 算法，基于前 30 个 PCA 维度 (FindClusters)
   • 可视化：RunUMAP 基于 Harmony 校正后的前 30 个主成分，生成二维嵌入

4. 细胞类型解卷积 (Cell type deconvolution)

   • 算法：RCTD (Robust Cell Type Decomposition)，来自 spacexr 包
   • 模式：full mode（更严格）
   • 参考：之前已经注释好的胰腺癌 sc/snRNA-seq 数据集
   • 输出：每个 spot 的细胞类型比例矩阵
   • 标准化：确保每个 spot 的比例和为 1

5. 空间生态位 (Spatial niches)

   • 定义：spot 群体，表现为相似的细胞类型组成。
   • 步骤：
   • 在高分辨率 (resolution = 2) 下聚类 spot。
   • 计算每个 cluster 的平均细胞类型比例。
   • 结合 UMAP 分布 & H&E 图像位置进行注释。
   • 最终：识别出 12 个不同的空间生态位 (spatial niches)。

6. 分组比较 (High-NI vs Low-NI)

   • 研究对象：神经侵犯 (Neural Invasion, NI) 高 vs 低的 PDAC 样本。
   • 方法：
     • 计算每个样本的 12 个 niche 所占比例
     • 用 ridge plot 展示分布差异

7. 外部验证 (Validation)

   • 验证队列：
     • 公共 PDAC ST 数据集 (n=8)
     • 自采独立样本 (n=2)
   • 神经侵犯 (NI) 状态由两名病理医师独立判定
   • 同样跑一遍 RCTD → 得到 cell type 分布 → 比较高 vs 低 NI

2. Spatial vicinity analysis（空间邻近性分析）#